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生命科學技術學院馮雁團隊在《Nucleic Acids Research》上發文: “Argonaute-PCR耦聯實現低豐度突變基因的超高靈敏度檢測”
發(fa)布時間 : 2021-04-30  閱讀(du)次數 : 551

近日,上海交通大學生命科學技術學院、微生物代謝國家重點實驗室馮雁團隊在Nucleic Acids Research上發表題為“Argonaute integrated single-tube PCR system enables supersensitive detection of rare mutations”的文章。該工作揭示了不同高溫微生物 Argonaute蛋白的核酸酶特性,發現其對單堿基突變(SNV)靶標序列精準識別的規律,發展了“一管式”PCR多重核酸富集和檢測的A-Star (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)新策略,實現血液等樣本中低豐度(du)突變基因的高效(xiao)、多重富集(ji)和(he)檢測。上海(hai)交(jiao)通(tong)大(da)學副(fu)研究(jiu)員(yuan)劉(liu)倩和(he)博士生郭(guo)翔為該(gai)論文共(gong)同第一作(zuo)者(zhe),馮雁(yan)教授為通(tong)訊作(zuo)者(zhe)。研究(jiu)工作(zuo)由上海(hai)交(jiao)通(tong)大(da)學、上海(hai)交(jiao)通(tong)大(da)學附(fu)屬第一醫院、仁(ren)濟醫院、人和(he)未來生物科技公(gong)司等合作(zuo)完成。上海(hai)交(jiao)通(tong)大(da)學轉化醫學中心提供研究(jiu)平臺支持。

對血液(ye)或體液(ye)中腫(zhong)瘤細胞釋放(fang)DNA片段的(de)(de)(de)液(ye)體活檢(jian),憑借其無(wu)創性、敏感性、動態性等(deng)特質(zhi),可實現腫(zhong)瘤早期篩查及伴隨診斷。然而,由于游離核酸(suan)含(han)量低和(he)(he)(he)易降解,因(yin)此在復雜背(bei)景基(ji)因(yin)中來(lai)特異性富(fu)集和(he)(he)(he)檢(jian)測腫(zhong)瘤基(ji)因(yin)得到廣泛關注。常用的(de)(de)(de)PCR等(deng)方法(fa)具有(you)簡(jian)單、省時(shi)等(deng)優點,但其檢(jian)測靈(ling)敏度有(you)限;近(jin)年來(lai),基(ji)因(yin)編輯工具酶(mei)CRISPR/Cas在核酸(suan)檢(jian)測中的(de)(de)(de)應用,提升了檢(jian)測靈(ling)敏度和(he)(he)(he)便捷性,但Cas酶(mei)對靶標序列PAM選擇性、長RNA guide合(he)成昂貴且不(bu)穩(wen)定等(deng)問題(ti),導致(zhi)檢(jian)測成本(ben)、靈(ling)敏度、多(duo)重性等(deng)方面仍存(cun)在局限性。因(yin)此,研(yan)發能特異性富(fu)集靶標序列的(de)(de)(de)新(xin)型核酸(suan)酶(mei)是解決上述難題(ti)的(de)(de)(de)有(you)效途徑,建立(li)高靈(ling)敏度、多(duo)重和(he)(he)(he)簡(jian)便的(de)(de)(de)新(xin)型核酸(suan)檢(jian)測技(ji)術對于基(ji)礎研(yan)究和(he)(he)(he)臨床應用都具有(you)重要意義。

 

圖(tu)1. “A-Star”低(di)豐度(du) SNV富集和檢測工作原理

論(lun)文作者(zhe)在對嗜(shi)熱微(wei)生物Ago蛋白的(de)系統研究中,揭示其高(gao)溫穩定性(xing)、可(ke)編程性(xing)、特異性(xing)催(cui)化活(huo)性(xing)、多(duo)重正交反應等優良特性(xing),提出了(le)Argonaute (Ago)核酸酶(mei)-PCR耦聯的(de)“A-Star” (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)核酸檢測和富(fu)集的新(xin)策略(圖1)。巧妙(miao)采用guide DNA“雙點錯配”設計的策略,使Ago蛋白(bai)在PCR變性步驟(zou)(94 oC)選(xuan)擇性(xing)剪切野(ye)生型基因,保(bao)留的突變基因可在PCR退火(huo)(~58 oC)、延伸(~72 oC)步驟中得以循環擴增,實現低豐度突變基因的超高效率富集和精準檢測。研究人員對KRAS、PIK3CAEGFR等多個腫瘤突變基因進行富集,證實A-Star能檢測0.01%的低豐度突變,富集效率高達5,500倍。

 

圖(tu)2. “A-Star”用(yong)于(yu)臨床樣品(A)及(ji)多重(zhong)腫瘤突變(B)的(de)富(fu)集和檢測 

“A-Star”在血液和實體瘤組織等復雜樣品中能穩定檢出靶標腫瘤基因(圖2A)。考慮到實際樣本中可能存在多種基因突變,通過設計多對DNA引導鏈,“A-Star”在單酶“一管式”反應體系中實現了多腫瘤基因的檢測,且信號之間無交叉干擾(圖2B)總之,本研究所建立的“A-Star”低豐度核酸富集和檢測技術,具有極高靈敏度、簡便快捷及多重檢測等分子檢測優勢,在基因診斷及遺傳疾病治療等分子生物學和醫學領域具有重要應用潛力。

本研究得到了國家(jia)自然科學基金(jin)面(mian)上項目(31770078)和科技部重點研發(fa)計(ji)劃(2020YFA0907700)的經費支(zhi)持(chi)。

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